乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的检测

誉诚医药生物 2018-09-23 12:43:15


近日,蒙牛纯牛奶被检测出强致癌物——黄曲霉毒素M1,消息一出顿时又掀起一股食品安全隐患的讨论。相比之前的三聚氰胺,黄曲霉素是否更难检测?

现整理出全套的专业检测方案,让乳和乳制品中黄曲霉毒素M1无处躲藏。

1. 试用范围

牛奶,奶粉,发酵乳,干酪,奶油等乳制品

2. 方法原理

黄曲霉毒素M1易溶于极性溶剂,因此均匀基质中的黄曲霉毒素M1可以通过甲醇/水震荡分散提取,对于高脂肪/油含量的样品基质加入正己烷予以脱脂。本方法采用免疫亲和柱净化,荧光检测器测定乳制品中黄曲霉毒素M1。

3. 所需设备和耗材

黄曲霉毒素免疫亲和柱:Welchrom? IAC (1ml,25支/盒;3ml,15支/盒)(上海月旭提供);

高效液相装置带荧光检测器;

均质机;

水平振荡器;

SPE转接头及50ml大容量上样器:Welchrom? SPE Adapter(上海月旭提供);

分析天平(精度0.02 g);

SPE装置带抽真空系统:Welchrom?  SPE Device(上海月旭提供);

黄曲霉毒素M1标准品;

PBS 缓冲溶液:称取1.16 g Na2HPO4,0.20 g KH2 PO4,8 g NaCl和0.2 g KCl 溶于900ml水中,用HCL或NaOH调节pH至7.4,然后定容至1000ml;

甲醇(色谱纯);

乙腈(色谱纯);

正己烷(分析纯)。

4. 样品前处理

牛奶样品

1. 称取25g(精确至0.01 g)混匀的样品,置于50 mL具塞离心管中,水浴加热至35℃~37 ℃,6000 r/min下离心10 min。收集全部上清液,待净化;

2. 发酵乳(包括固体状、半固体状和带果肉型)

3. 称取25 g(精确至0.01 g)混匀的样品,用0.5mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.4,9500r/min下均质5 min,水浴加热至35℃~37 ℃,6000 r/min下离心10 min。收集全部上清液,待净化。

4. 乳粉和粉状婴幼儿配方乳制品

5. 称取10 g(精确至0.01 g)样品置于250 mL烧杯中,加入50 mL约50 ℃的水于乳粉中,玻璃棒搅拌均匀。溶解后冷却至室温,移入100 mL容量瓶中,水洗烧杯并转移洗涤液,用PBS定容至刻度后装入离心管6000转/分钟下离心15 min,混合上清液,取50mL上清液待净化。

干酪

切取均质的样品5g(精确至0.01 g)于50 mL离心管中,加2 mL水和30 mL甲醇,9500 r/min下匀浆5 min,超声提取30 min,6000r/min下离心10 min。收集上清液并移入250 mL分液漏斗中,同时加入30 mL正己烷,振摇2 min,分层后,弃去正己烷层。重复用正己烷提取2次。提取液减压浓缩至约2 mL,转移浓缩液至离心管,烧瓶用甲醇-水溶液(1+4)5 mL分2次洗涤并倒入50 mL离心管中,加PBS溶液稀释至50 mL,6000r/min下离心5 min,上清液待净化。

奶油

称取5g(精确至0.01 g)试样,置于50 mL烧杯中,用20 mL正己烷将其溶解并移于250mL具塞锥形瓶中。加20 mL水和30 mL甲醇,振荡30 min后,将全部液体移于分液漏斗中,待分层后,将下层溶液全部移到100 mL圆底烧瓶中,旋转蒸发仪减压浓缩至约5 mL,加PBS稀释至约50mL,待净化。

5. 免疫亲和柱净化(3cc)

1. 将IAC装于固相萃取装置上,接上大体积上样器,10ml PBS溶液活化柱子,流速保持在2–3 ml/min,确保上样前柱子保留少量(0.5ml)的PBS溶液,活化液不收集;

2. 将待净化液加入免疫亲和柱,流速不超过5 mL/min,不收集流出液;

3. 用约20ml去离子水淋洗柱子,流速不超过5 mL/min,抽真空1分钟,不收集流出液;

4. 用1.5ml甲醇洗脱,流速控制在1d/s,收集洗脱液过膜后上机测试。

注:免疫亲和柱从冰箱去除需升到室温后使用

6. 色谱条件:

色谱柱:   Ultimate? XB-C18 250 mm x 4.6 mm,5μm(上海月旭提供)

预柱:     Ultimate? C18,5μm,ULT5BG18(上海月旭提供)

流动相:   水:甲醇:乙腈=11:4:5

柱温:     35℃

检测波长: 发射波长:365nm,激发波长:450nm

进样量:   100μL



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